動態濁度法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內毒素含量

來源：http://www.ssygc.com/ 作者：余氯檢測儀 時間：2018-07-25

　　[目的] 建立動態濁度法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內毒素含量的方法。

　　[方法] 通過對樣品中定量添加標準內毒素的干擾試驗，檢測其回收率應在50%～200%范圍。

　　[結果] 人凝血酶原復合物制品對鱟試驗無干擾作用，動態濁度法定量檢測結果與家兔實驗結果基本一致。

　　[結論] 應用本方法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內毒素含量是可行的。

　　關鍵詞： 人凝血酶原復合物; 細菌內毒素; 動態濁度法; 鱟試驗

　　人凝血酶原復合物臨床上主要用于治療先天性和獲得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏癥[1-2]。依據2010年版《中國藥典》三部規定，人凝血酶原復合物制品中熱原檢查是采用家兔法，但此法操作繁瑣，時間長且費用高，不適用于制品的生產過程控制和成品的大規模熱原檢測，故需建立一種快速測定的方法，用于人凝血酶原復合物生產過程中細菌內毒素含量的控制。筆者參閱了有關文獻[3-4]，初步建立了動態濁度法定量測定人凝血酶原復合物制品中細菌內毒素含量的方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 樣品和儀器

　　人凝血酶原復合物(批號為20110610、20110711、20110712、20110713、20110714、20110815、20110816、20110919、 Test1、Test2、Test3，規格為300 IU/瓶);細菌內毒素檢查用水(批號為1010130，規格為5 mL/支，湛江安度斯生物有限公司);動態濁度法鱟試劑(批號為1010142，規格為1.25 mL/支，λ=0.03 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司);細菌內毒素工作標準品(批號為150601-201071，規格為90 EU/ 支，中國藥品生物制品檢定所)。Bioprobe—2002型細菌內毒素測定儀，XW-80A型旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細菌內毒素限值(L)的確定 采用公式為：L=K/M，式中K為規定的給藥途徑，人每千克質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K=5 EU/(kg.h);M為每千克質量每小時的最大給藥劑量為30 IU/(kg.h)。計算得樣品的內毒素限值L為0.167 EU/IU。

　　1.2.2 標準曲線制備及可靠性試驗 用細菌內毒素檢查用水(BET)水1 mL溶解細菌內毒素工作標準品，置漩渦混合器上混合15 min，然后逐級稀釋(每步不超過10倍)至最終細菌內毒素濃度分別為2.00、0.25、0.03125 EU/mL,3個標準品溶液各取0.10 mL，分別加到預先加有0.10 mL動態濁度法鱟試劑的試管內，混勻，立即插入Bioprobe—2002型細菌內毒素測定儀內，37℃1 h自動檢測，每個濃度重復3管，并同時做陰性對照2管。

　　1.2.3 干擾實驗

　　① 樣品最大稀釋倍數計算:公式為MVD=LC/λ1，式中λ1為動態濁度法標準曲線中最低點細菌內毒素濃度0.03125 EU/mL;L為供試品的細菌內毒素限值0.167 EU/IU;C為10 IU/mL。計算得人凝血酶原復合物最大有效稀釋倍數MVD為53倍。

　　② 樣品溶液配制及干擾實驗:取人凝血酶原復合物樣品(批號為20110610，規格為300 IU/mL)用30 mL水復溶，然后用BET水稀釋為5、10、20、40、50倍溶液，作為樣品溶液，記為Ai液。同時進行同樣倍數稀釋，但在稀釋液中添加濃度為0.25 EU/mL或0.50 EU/mL的細菌內毒素標準品，作為內毒素陽性對照管，記為Bi液。分別吸取上述各液0.10 mL，加入預先加有0.10 mL動態濁度法鱟試劑(TAL)的試管內混勻，立即插入Bioprobe—2002型細菌內毒素測定儀內自動檢測，每個濃度重復3管，計算回收率。回收率(%)=(Bi液內毒素值-Ai液內毒素值)/添加內毒素濃度λ×100%。

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