雙光徑濁度儀在疫苗細(xì)菌濃度檢測上的應(yīng)用

來源：http://www.ssygc.com/ 作者：余氯檢測儀 時間：2020-12-27

　　1977年美國許可了14價肺炎球菌多糖疫苗和4價流腦疫苗后，這些莢膜多糖的檢測標(biāo)準(zhǔn)均為依靠物化和血清學(xué)的分析方法分析大量粉劑。隨后又發(fā)展了一種免疫電泳的方法用來測定肺炎成品疫苗中的多糖含量。微生物實驗室細(xì)菌濁度儀

　　經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)速率比濁儀(LSR nephelomety)除了被用于分析抗原抗體之間的動態(tài)反應(yīng)來檢測蛋白濃度外，還可用來定量測定多糖。

　　在23價肺炎球菌多糖疫苗成品質(zhì)控項目中，23型肺炎球菌多糖定量是疫苗的重要檢測項目之一。速率散射濁度法(LSR)則是測定各型肺炎多糖含量的主要方法。因為利用了抗原抗體的特異性反應(yīng)，所以可以準(zhǔn)確地檢測23價肺炎多糖疫苗中各型多糖的含量。不同于普通化學(xué)檢測方法無法準(zhǔn)確區(qū)分各型肺炎球菌多糖，該方法更為精確，并有較高的靈敏度。豐臨科技的雙光徑免疫濁度分析儀的工作原理就是基于速率散射濁度法。為此，我們對用IMMAGE測定8型肺炎球菌莢膜多糖進(jìn)行了系統(tǒng)的評估，并討論其檢測實用性。

　　1材料與方法

　　1. 1肺炎球菌多糖

　　8、19F、5、17F、33F、10A六個型別的肺炎球菌精制多糖。1.2血清

　　8型肺炎血清來源于丹麥國立血清研究所。

　　1.3相對標(biāo)準(zhǔn)品

　　各項生化檢測指標(biāo)均合格的肺炎精制多糖，經(jīng)凍干衡重，精確標(biāo)定后，保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4儀器

　　貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的雙光徑免疫濁度分析儀(IMMAGE)，UDR試劑盒以及配套的緩沖液buffer 1、稀釋液dilution 1，由貝克曼庫爾特公司提供。

　　1.5方法

　　先將相對標(biāo)準(zhǔn)品放入IMMAGE的樣品盤中，將血清倒入試劑盒放入試劑盤中，進(jìn)入IMMAGE的用戶自定義試劑(UDR)系統(tǒng)，使用自建的用戶自定義檢測項目，進(jìn)行定標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將檢測樣品放入樣品盤中，用自定義檢測項目測定樣品。儀器可通過多點定標(biāo)曲線自動計算樣本中的多糖含量。

　　1.6統(tǒng)計學(xué)處理

　　采用Microsoft Excel 2003和SPSS統(tǒng)計軟件處理檢測數(shù)據(jù)。測定結(jié)果以x±s表示，兩樣本均數(shù)用t檢驗。

　　2結(jié)果

　　2.1重復(fù)性測定

　　用8型肺炎球菌血清分別測定標(biāo)示量分別為2.0、1.5、1.0的A、B、C3個8型肺炎多糖樣品各10次，結(jié)果見表1。

　　2.2回收率測定

　　用8型肺炎球菌血清重復(fù)測定8型肺炎多糖樣品10次,回收率為(99.25±0.02)%(表2)。

　　2.3靈敏度

　　用零濃度的空白液連續(xù)檢測10次。測定結(jié)果為(0.120±0.016)μg/mL,計算分析靈敏度為0.2 μg/mL(表3)。

　　2.4稀釋實驗

　　將樣品分別稀釋15、20、30、40倍，重復(fù)檢測3次，回收率為96.40% ～ 104.35%，平均值為99.82% 。回歸方程為:Y=28.759X + 0.0369，r = 0.998(表4)。

　　2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性

　　用相對標(biāo)準(zhǔn)品配制3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)物，將標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)物作為樣品檢測，每天測定1次，每次雙份測定，連續(xù)5 d。經(jīng)t檢驗，校準(zhǔn)物的測定結(jié)果與定值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，標(biāo)準(zhǔn)曲線至少可穩(wěn)定5 d。

　　2.6干擾實驗

　　采用配對差異試驗法，建立8型肺炎球菌多糖樣品對照組和加入3個濃度的干擾物的試驗組，每組樣品同時測定3次。計算干擾百分率(P)。干擾物為8、19F、5、17F、33F、10A六個血清型的肺炎球菌多糖。檢測結(jié)果干擾百分率(P)為1.35%～2.37%，配對t檢驗分析加入干擾物前后的肺炎8型多糖測定結(jié)果表明，8型肺炎球菌多糖樣品中加入8、19F、5、17F、33F、10A六個型別的肺炎多糖及濃度對IMMAGE測定8型肺炎球菌多糖無明顯干擾(P>0.05)。

　　3討論

　　23價肺炎球菌多糖疫苗含有1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F共23個血清型的肺炎球菌多糖。疫苗中各型肺炎多糖含量是一個重要的質(zhì)量指標(biāo)。目前速率散射濁度法(LSR)是定量測定多價肺炎球菌多糖疫苗的重要方法之一。該方法是建立在免疫反應(yīng)聚合物形成速率的基礎(chǔ)上，同時由于抗原抗體反應(yīng)的特異性，LSR法能夠區(qū)分并準(zhǔn)確測定出23價肺炎多糖疫苗中各個血清型的多糖含量。起初該方法是被廣泛用于研究蛋白抗原與它的特異性抗體的反應(yīng)[1]，用在檢測多糖抗原抗體反應(yīng)方面不多。

　　雙光徑免疫濁度分析儀(IMMAGE)由于采用了近紅外波長檢測手段和顆粒包被技術(shù)使其檢測精密度大大提高。并且IMMAGE的用戶自定義試劑(UDR)系統(tǒng)方便了用戶建立自定義檢測項目，用戶可以根據(jù)實際工作需要自行編輯反應(yīng)參數(shù)，如樣品、試劑的用量、反應(yīng)時間、反應(yīng)類型等。在用戶對自定義項目定標(biāo)完成后，該系統(tǒng)可以根據(jù)用戶的選擇自動計算標(biāo)準(zhǔn)曲線,顯示相關(guān)參數(shù)，用戶可以節(jié)約自己換算的時間。并且，電腦會自動存儲標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)，在檢測樣品時自動計算結(jié)果。IMMAGE采用封閉式自動化檢測系統(tǒng)，其加樣、稀釋、反應(yīng)、洗滌和分析等快速全自動化，在15min內(nèi)可獲得測定結(jié)果，可作為多價肺炎多糖疫苗定量測定手段。本文結(jié)果表明，IMMAGE測定8型肺炎球菌多糖具有較好的精密度、重復(fù)性，CV均小于5%，測定樣品時有較好的回收率，回收率為(99.25±0.02)%。分析靈敏度為0.2 μg/mL。此法有較好的稀釋線性，平均回收率為99.82%。標(biāo)準(zhǔn)曲線至少可以穩(wěn)定5 d。加入19F、5、17F、33F、10A五個型別的肺炎球菌多糖(含量<100 μg/mL)對檢測無顯著性干擾。初步的研究結(jié)果證明，采用IMMAGE定量測定23價肺炎球菌多糖疫苗樣品中8型肺炎多糖含量是準(zhǔn)確、可靠的，有較高的靈敏度和精密度，并且快捷、高效。

　　4參考文獻(xiàn)

　　[1]Chi-Jen lee. The Quantitatative Immunochemical Determination of Pneumococca Capsular Polysaccharide by Light scatlering Quantitative Rate Nephelornetry of Biol[J]. Stand,1983，11:55-64.

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