濁度法測定12-去羥基阿奇霉素的效價

來源：http://www.ssygc.com/ 作者：余氯檢測儀 時間：2019-01-04

　　【摘要】 目的 建立濁度法測定12.去羥基阿奇霉素效價的方法。方法 以肺炎克雷伯菌為試驗菌，加菌量0.6%~1.0%(V/V)，37℃±0.5℃培養4 h左右測定。結果 抗生素線性濃度為2.0~10.0 U/ml，二劑量法原料的平均回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。結論 本方法靈敏，快速，影響因素較少，可作為測定12.去羥基阿奇霉素的效價的方法。

　　【關鍵詞】 效價;濁度法;12.去羥基阿奇霉素

　　12-去羥基阿奇霉素是由紅霉素C為原料，通過化學合成的方法合成的。本藥物屬廣譜抗菌藥， 對大多數革蘭陰性細菌以及細胞內病原菌、支原體和衣原體等有較好的抗菌活性，對革蘭氏陽性細菌也有一定的抗菌活性。其抗菌活性較阿奇霉素為強。

　　本藥物屬于新藥，目前尚無含量測定方法。本文建立了濁度法測定12.去羥基阿奇霉素效價的方法。通過對12.去羥基阿奇霉素用比濁法測定其效價的研究，即可直觀反應藥物的抗菌活力，又可在檢測當天獲得實驗結果。

　　1 儀器與試劑

　　CBZ.1抗生素光度比濁法測量儀、石英培養杯(厚度1 cm)，北京潮聲公司。

　　肺炎克雷伯菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44 103]，由中國藥品生物制品檢定所提供。

　　阿奇霉素標準品(批號：130352.200405含量：936 U/mg)由中國藥品生物制品檢定所提供。12.去羥基阿奇霉素(河北省藥品檢驗所自主合成)。

　　抗生素檢定培養基Ⅲ號(pH7.8，批號060403)由北京三藥科技開發公司提供(中國藥品生物制品檢定所監制);滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)均按中國藥典2005年版二部附錄配制。

　　2 方法與結果

　　2.1 一劑量法

　　2.1.1 菌液的配制 取肺炎克雷伯菌的營養瓊脂斜面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，在35℃~37℃培養18~22 h，臨用時，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下;取新鮮的菌懸液適量，加12%甲醛液1 ml殺滅，加生理鹽水做適當的稀釋，使得其在580 nm波長處的吸收值為1.0，記錄其稀釋所用的生理鹽水的毫升數和1 ml 12%甲醛液的總毫升數，再將原菌液按此比例稀釋，即為試驗菌液。取試驗菌液0.6~1.0 ml加至培養基100 ml中，搖勻，為實驗菌液。

　　2.1.2 溶液的配制 標準品溶液取阿奇霉素標準品適量，精密稱取，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)進一步稀釋成2、4、5、8、10 U/ml的標準品溶液。

　　2.1.3 培養與測定 取標準品溶液1.0 ml，加入滅菌培養管中，再加入實驗菌液9.0 ml，置抗生素比濁法測量儀內，于37℃培養。另取稀釋溶劑1.0 ml，加空白培養基9.0 ml，混勻，作為空白對照，儀器在線于530 nm的波長處測定各管肺炎克雷伯菌對數生長期內不同培養時間下的吸光度值(A)。根據量反應平行線原理計算供試品的效價值。

　　2.2 二劑量法

　　2.2.1 溶液的配制 ①標準品溶液精密量取阿奇霉素標準品儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的標準品溶液;②供試品溶液取12.去羥基阿奇霉素適量，加乙醇溶解并用水稀釋成1 000 μg/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取12.去羥基阿奇霉素儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成4.0 U/ml和8.0 U/ml的供試品溶液。

　　2.2.2 菌液的配制 同2.1.2項下制備方法。

　　2.2.3 培養與測定 同2.1.3項下方法。

　　2.3 線性與范圍的測定 照抗生素微生物檢定一劑量法測定，并以各組濃度標準品溶液所致菌液吸收度的值對溶液對數濃度進行線性回歸，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數分別為：

　　回歸直線方程 Y=bX+a=.0.471 5 X+0.832 6相關系數r=0.995 5。

　　結果表明：采用標準品溶液進行一劑量法試驗，在2~10 U/ml的濃度范圍里，呈良好的線性關系。

　　2.4 回收率試驗 精密稱取阿奇霉素標準品及一批已知含量的12.去羥基阿奇霉素原料樣品，精密稱定，加乙醇溶解并用水稀釋成800、1 000、1 200 U/ml的溶液，作為儲備液備用;精密量取儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.8)稀釋制成3.2和6.4 U/ml、4.0和8.0 U/ml、5.0和10.0 U/ml的供試品溶液。在上述條件下測定，測得回收率結果為平均加樣回收率為101.2%，RSD為2.2%(n=9)。

　　2.5 重復性試驗 用已知含量的12.去羥基阿奇霉素樣品一批，共測定6次，結果平均含量為950 U/mg，RSD為1.8%。

　　2.6 穩定性考察 主要考察了抗生素溶液，即貯備溶液和測定溶液穩定性對測定結果的影響。

　　結果表明：本品的濃溶液和點樣用稀溶液放置冰箱保存可穩定2 d，完全可以滿足實驗的需要。

　　2.7 專屬性考察 采用回收率試驗進行驗證，結果見2.4。

　　2.8 樣品測定 按上述濁度法測定法的二劑量法，進行試驗，結果見表1。

　　3 討論

　　3.1 測定條件的選擇

　　3.1.1 實驗菌、培養基及加菌量的選擇 12.去羥基阿奇霉素為廣譜抗生素，對大多數革蘭氏陰性細菌敏感，對革蘭氏陽性細菌也有一定的抗菌活性。曾選用金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌同時作實驗，發現肺炎克雷伯菌對于本品種來說更為敏感。因此，本研究選擇肺炎克雷伯菌作為實驗菌。培養基采用國內外藥典通用的抗生素檢定培養基Ⅲ號，pH為7.0，滅菌后為澄清的液體培養基，適合肺炎克雷伯菌生長。

　　菌液濃度：比濁側定時，菌液過濃亦可使濃度.吸收度不成直線關系;但菌液濃度過稀，則讀數偏低，誤差增大。一般控制吸收度讀數在0.3~0.7較為適宜。

　　3.1.2 測定時間的選擇 采用試驗菌的不同傳代次數(3、4、5代)及不同加菌量(0.6~1.0%)，以不同抗生素濃度試驗，觀察試驗菌的生長曲線。發現，在4 h左右可達到所需濃度范圍(即培養一定時間后，吸光度應在0.3~0.7，劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1)。

　　3.1.3 時間的一致性 主要是使每管的培養時間相等，實驗時在試管中加入含試驗菌液的培養基后，應立即加入標準品溶液和供試品溶液，混合均勻。必要時可先將培養基冷卻至2℃~4℃左右，再接種菌種，并在此溫度下，將含菌培養基加至各試管中，可避免加注試管先后的誤差。培養終止時原應將各管同時放入冰浴中，并盡快加入甲醛溶液滅活，使各試驗管的培養時間一致，現采用儀器在線測定，則不需此項操作。

　　3.2 濁度法具有快速(試驗過程3~4 h，加上其他操作，可在當天獲得結果)，易于操作，結果用儀器測定，便于自動化操作等優點;更重要的是采用液體培養基，消除了多組分抗生素在固體培養基中擴散不同的影響，使得試驗的靈敏度高，精密度和準確度都較瓊脂擴散法好。但濁度法對試驗儀器的性能及試驗器具的要求較高(如：培養溫度要求一致，比色管的清潔等)，另外，任何影響液體培養基內微生物生長的因素都會影響抗生素效價的測定，這是其缺點。因此，隨著大量單組分抗生素采用HPLC法測定含量，濁度法將成為不易采用HPLC法的抗生素和多組分抗生素效價測定的主流。12.去羥基阿奇霉素。

　　參考文獻

　　1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2005年版二部).化學工業出版社，2005:82.

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