濁度法測定硫酸小諾霉素效價(jià)的方法

來源：http://www.ssygc.com/ 作者：余氯檢測儀 時(shí)間：2019-01-04

　　[摘要] 目的:建立濁度法測定硫酸小諾霉素效價(jià)的方法。方法:采用濁度法測定硫酸小諾霉素的效價(jià),并將濁度法與管碟法測定結(jié)果相比較。

　　結(jié)果:濁度法與管碟法測定結(jié)果一致,濁度法測定結(jié)果可信限率較低。結(jié)論:本法簡便、快捷,可用于硫酸小諾霉素的效價(jià)測定。

　　[關(guān)鍵詞] 濁度法;硫酸小諾霉素;效價(jià);管碟法

　　硫酸小諾霉素為廣譜氨基糖苷類抗生素,耳毒性和腎毒性較低,對(duì)6-N-乙酰酯酶抗藥性菌有效,有強(qiáng)大和快速的抗菌能力,在治療由革蘭陰性菌如銅綠假細(xì)胞菌、大腸埃希菌等引起的感染時(shí),與內(nèi)酰胺類抗生素有協(xié)同作用。目前該藥物及其制劑采用管碟法作為含量測定的方法,但管碟法為傳統(tǒng)方法,雖能直觀反映其體外抗菌能力,但是管碟法進(jìn)行過程中影響因素頗多,而且消耗人力大,花費(fèi)時(shí)間長;濁度法既能彌補(bǔ)這些缺點(diǎn),又具有測定結(jié)果精密度高。本研究建立濁度法測定硫酸小諾霉素效價(jià)的方法,即可直觀反映藥物的抗菌活性,又可在檢測當(dāng)天獲得結(jié)果,靈敏、快速,可作為硫酸小諾霉素效價(jià)的測定方法[1]。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器

　　抑菌圈測量分析儀ZY-300IV型、微生物比濁法測定儀WBS-100型(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司);BP-211D分析天平(SARTORIUS公司);UV-2401型紫外分光光度計(jì)(日本島津)。

　　1.2 試藥

　　大腸埃希菌[CMCC(B)44103];硫酸小諾霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):130342-200703,效價(jià):574 U/mg);培養(yǎng)基Ⅲ(批號(hào):060403,中國藥品生物制品檢定所);硫酸小諾霉素原料藥(山西省侯馬市平陽制藥廠);氯化鈉,磷酸氫二鉀,磷酸二氫鉀,均為分析純。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 實(shí)驗(yàn)條件

　　2.1.1 大腸埃希菌懸液的制備取大腸埃希菌[CMCC(B)44103]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物,接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上,在35～37℃培養(yǎng)20～22 h,然后用滅菌水將菌苔洗下,并加滅菌水稀釋,使其在580 nm波長處的吸收度為1.0。

　　2.1.2 試驗(yàn)菌懸液加入量的選擇 取大腸埃希菌懸液,加入到培養(yǎng)基中,制成含菌濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的培養(yǎng)基,培養(yǎng)2.5 h,在580 nm處測定吸收度,結(jié)果含3%菌液濃度在3%時(shí),吸收度為0.52,符合要求,故選3%的菌液濃度。

　　2.1.3 抗生素溶液配制精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品和原料藥適量,加滅菌水溶解,配制成1 000 U/mg的溶液,精密量取此溶液適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋至最終濃度為10 U/mg和20 U/mg(劑間比為1∶2)。

　　2.1.4 抗生素溶液的分裝 取已滅菌的石英比色管16支,分別為ds14支、ds24支、dT14支、dT24支,分別標(biāo)記,精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液ds1、ds2及dT1、dT2各1.0 ml,按編號(hào)加入相應(yīng)比色管中。

　　2.1.5 含菌培養(yǎng)基的分裝在培養(yǎng)基中加入一定量試驗(yàn)菌(3%),用已滅菌的刻度吸管分裝至比色管中,每管分裝9.0 ml,立即振搖,混合均勻。

　　2.1.6 培養(yǎng)、測量與計(jì)算使用WBS-100微生物比濁儀,恒溫培養(yǎng),定時(shí)振蕩,在線測量,計(jì)算結(jié)果[2]。

　　2.2 線性范圍考察

　　稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量,加滅菌水制成1 000 U/mg的溶液,分別精密吸取此液適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋成8、10、12、16、20、24、30、35、40 U/mg的溶液。分別精密量取上述各溶液1.0 ml,置滅菌比色皿中,每個(gè)濃度3管,分別加入含菌培養(yǎng)基9.0 ml,立即搖勻,在濁度測定儀中培養(yǎng)3.5 h,以培養(yǎng)基為空白,在580 nm處測定吸收值,以吸收值(A)為縱坐標(biāo),以濃度(C)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程為Y=2.634 2-1.294 6lgC(r=0.998 2),說明在40～80 U/mg濃度范圍內(nèi),抗生素濃度的對(duì)數(shù)與吸收值線性關(guān)系良好[3]。在線性濃度范圍內(nèi)選取硫酸小諾霉素的高低劑量在24、12 U/mg所測定的A值基本在0.4～0.6范圍內(nèi),高低計(jì)量為2∶1,可作為效價(jià)測定的抗生素溶液濃度。培養(yǎng)基接種菌量約為3%,菌懸液在580 nm處的吸收度為約1.0,試驗(yàn)結(jié)果較為理想。

　　2.3 準(zhǔn)確度與精密度考察

　　2.3.1 回收率試驗(yàn)選擇 90%、100%、110%三點(diǎn)進(jìn)行回收率試驗(yàn)。①90%樣品溶液制備:分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 000 U/mg)4.5、9.0 ml,用pH=7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋成高低濃度分別為9、18 U/mg的抗生素溶液。②100%樣品溶液制備:分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 000 U/mg)5、10 ml,用pH=7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋成高低濃度分別為10、20 U/mg的抗生素溶液。③110%樣品溶液制備:分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 000 U/mg)5.5、11.0 ml,用pH=7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋成高低濃度分別為11、22 U/mg的抗生素溶液。分別取上述溶液,按照濁度法操作,結(jié)果回收率分別為100.51%、100.27%、100.34%。

　　2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品,配制6份供試品溶液,進(jìn)行測定,于1 d內(nèi)完成,結(jié)果6份供試液效價(jià)均值為562 U/mg,RSD為5.8%。提示該抗生素溶液不宜久放,時(shí)間因素對(duì)測定結(jié)果影響較大,試驗(yàn)時(shí)溶液應(yīng)臨用新制。

　　2.3.3 樣品含量測定取硫酸小諾霉素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品適量,精密稱定,用滅菌水制成1 000 U/mg的溶液,分別精密吸取此液適量,用滅菌磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)稀釋制成10、20 U/mg濃度的高低劑量溶液,高低計(jì)量劑間比為2∶1,分別精密量取上述溶液各1.0 ml,置滅菌比色管中,各6管,分別加入3%大腸埃希菌液培養(yǎng)基9.0 ml,立即搖勻,在濁度測定儀中培養(yǎng)3.5 h。按“2.1.6”項(xiàng)下方法測定。陰性對(duì)照:pH=7.0磷酸鹽緩沖液1.0 ml,加9.0 ml未接種實(shí)驗(yàn)菌的培養(yǎng)基。分別用濁度法與管碟法的二劑量法對(duì)5批硫酸小諾霉素原料藥進(jìn)行測定,并測定結(jié)果進(jìn)行比較(n=5),結(jié)果見表1。

　　表 1 濁度法與管碟法的測定結(jié)果比較

　　原料藥標(biāo)示效價(jià):574 U/mg

　　對(duì)樣品及原料藥用比濁法和管碟法測得的含量和可信限率FL(%)進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果無顯著性差異(P>0.05),比濁法的可信限率優(yōu)于管碟法[4]。

　　3 討論

　　試驗(yàn)菌必須具有穩(wěn)定性,對(duì)于實(shí)驗(yàn)來說,它是決定性因素,因此在菌懸液的制備過程中,需嚴(yán)格控制菌種斜面的質(zhì)量和菌種培養(yǎng)的溫度和時(shí)間。培養(yǎng)溫度為37℃,時(shí)間應(yīng)不少于22 h,菌液應(yīng)質(zhì)細(xì)、均勻[5]。

　　試驗(yàn)菌的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基必須色澤淺、質(zhì)澄清,靈敏度應(yīng)高,應(yīng)能保證試驗(yàn)菌生長良好。特別要控制pH值,若pH值不適合,試驗(yàn)菌生長緩慢,在規(guī)定時(shí)間內(nèi)形成的濁度達(dá)不到要求。若增加培養(yǎng)時(shí)間,則實(shí)驗(yàn)精密度隨之較差[6]。

　　試驗(yàn)中嚴(yán)格防止微生物和抗生素的污染相對(duì)而言,微生物污染對(duì)濁度法的影響要比管碟法要大,濁度法培養(yǎng)時(shí),比色管必須潔凈,其他抗生素或污染菌與試驗(yàn)菌混合在一起同時(shí)生長,這樣將導(dǎo)致生物反應(yīng)紊亂,造成同濃度各管的吸收度差別增大,可信限率顯著增高,影響效價(jià)測定結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度[7-8]。

　　試驗(yàn)中溫度對(duì)結(jié)果的影響較大,應(yīng)保持溫度恒定、均勻,各管如受熱不夠均勻,則平行試驗(yàn)的結(jié)果不好,所以各管應(yīng)隨機(jī)放置,以消除局部溫度不均勻?qū)?xì)菌生長的的影響。定時(shí)振搖可使細(xì)菌均勻生長,上下濁度一致,縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

　　試驗(yàn)中培養(yǎng)時(shí)間控制得是否準(zhǔn)確也非常重要,試驗(yàn)時(shí)各管最好按一定時(shí)間間隔加入含菌培養(yǎng)基,測量時(shí)也按同一時(shí)間間隔測量,控制試驗(yàn)偏差較小在較小的范圍內(nèi)(±5%)。

　　實(shí)驗(yàn)表明,采用濁度法與管碟法測定硫酸小諾霉素原料,結(jié)果一致,濁度法操作方便,重現(xiàn)性較好,可以用于硫酸小諾霉素原料的效價(jià)測定。本次研究還考察了濁度法測定硫酸小諾霉素制劑效價(jià)的可行性,結(jié)果表明濁度法完全可以用于測定該品種片劑,實(shí)驗(yàn)中若將高低濃度抗生素溶液過濾,則可減小輔料的影響,結(jié)果的可信限率將更低。

　　[參考文獻(xiàn)]

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